viernes, 16 de febrero de 2018

Nuevas tijeras moleculares CRISPR para el diagnóstico de enfermedades - JANO.es - ELSEVIER

Nuevas tijeras moleculares CRISPR para el diagnóstico de enfermedades - JANO.es - ELSEVIER



PUBLICADO EN 'SCIENCE'

Nuevas tijeras moleculares CRISPR para el diagnóstico de enfermedades

JANO.es · 15 febrero 2018 00:45
Científicos de la Universidad de California y del Broad Institute del MIT emplean los bisturís moleculares Cas12a y Cas13 para desarrollar plataformas de detección de ácidos nucleicos con las que diagnosticar el papiloma, el zika o el dengue.
  • Investigadores del Broad Institute sostienen una tira de papel que muestra una lectura positiva del sistema SHERLOCK para la detección de virus, basado en CRISPR. / BROAD INSTITUTE - MIT
Los laboratorios de dos de los líderes mundiales en edición genética, la catedrática Jennifer Doudna de la Universidad de California en Berkeley y el investigador Feng Zhang del Broad Institute del Massachusetts Institute of Tecnology (MIT), han presentado esta semana en Science estudios separados sobre dos plataformas basadas en CRISPR para detectar enfermedades, denominadas DETECTR y SHERLOCK, respectivamente.

Ambas instituciones mantienen en la actualidad una disputa por una serie de patentes de las aplicaciones de la técnica de corta-pega genético CRISPR Cas9, descubierta en 2012 por Doudna y la bioquímica francesa Emmanuelle Charpentier.

En esta ocasión, las nuevas plataformas de diagnóstico anunciadas no han usado la proteína Cas9, sino otras denominadas Cas12a y Cas13, que cortan el ADN de manera distinta a Cas9. Según los investigadores, estos bisturís moleculares tienen unas características que los hace idóneos para detectar ácidos nucleicos.

Janice Chen, Enbo Ma y Lucas Harrington, investigadores principales del estudio del laboratorio de Doudna, han utilizado la proteína Cas12a, descubierta en 2015 y originalmente llamada Cpf1. Durante la investigación, observaron una actividad inesperada de esta proteína: cuando se une y corta una secuencia de ADN de doble cadena dirigida, desata el corte indiscriminado de todo el ADN de cadena sencilla en un tubo de ensayo.
“La mayor parte del ADN de una célula tiene forma de hélice de doble cadena, por lo que no es necesariamente un problema para las aplicaciones de edición de genes”, explican los autores. “Pero nos permite utilizar una molécula ‘indicadora’ de cadena sencilla con la proteína CRISPR-Cas12a, que produce una señal fluorescente cuando ha encontrado su objetivo”.
El experto Lluís Montoliu, del Centro Nacional de Biotecnología, que no ha participado en el estudio, explica a Sinc este proceso de una forma más sencilla: "La enzima Cas12a corta ADN de doble cadena guiada por una molecula de ARN, que se empareja con el gen diana deseado (al igual que hace la conocida nucleasa Cas9), pero luego 'se vuelve loca' y empieza a cortar moleculas de ADN de cadena sencilla que puede haber en la mezcla de un tubo de ensayo".
“Y si has tenido la precaución de añadir compuestos flurorescentes que empiecen a brillar cuando estas hebras son cortadas, entonces has convertido un problema –el que la Cas12a corte indiscriminadamente– en un extraordinario y ultrasensible método de detección de ácidos nucleicos, que puedes aplicar para detectar minúsculas cantidades de un virus en una muestra de sangre, por ejemplo”.
Plataforma de detección de ácidos nucleicos
Aprovechando esta actividad, los investigadores de UC Berkley han desarrollado una plataforma de detección de ácidos nucleicos, llamada DETECTR, capaz de  identificar con éxito la presencia del virus del papiloma humano (VPH) en muestras clínicas, incluso con pequeñas cantidades de ADN. “La tecnología es altamente sensible, rápida y específica y puede distinguir los tipos VPH16 y VPH18”, dicen los autores.
“Esta proteína funciona como una herramienta robusta para detectar ADN en una gran variedad de fuentes", señala Chen. "La tecnología podrá aplicarse en el diagnóstico de múltiples enfermedades, incluido el cáncer y las enfermedades infecciosas", agrega.
La actividad de la proteína Cas12a es similar a la de las enzimas CRISPR Cas13a, que degrada el ARN después de unirse a una secuencia de ARN diana. Varios equipos, incluido el de Doudna, están desarrollando pruebas de diagnóstico usando Cas13a que podría, por ejemplo, detectar el genoma del ARN del VIH.
“Seguimos fascinados por las funciones de los sistemas CRISPR bacterianos y por la forma en que la comprensión de sus mecanismos genera oportunidades para desarrollar nuevas herramientas”, destaca Doudna.
Molécula de señalización
Por su parte, el laboratorio de Feng Zhang en el Broad Institute ha desarrollado una versión mejorada de su sistema CRISPR de detección de ácidos nucleicos SHERLOCK. Los investigadores han utilizado enzimas Cas13, en combinación con Cas12a y Csm6, para detectar diferentes objetivos, como el virus del zika y del dengue.
El laboratorio de Zhang ha desarrollado un test basado en CRISPR que usa una tira de papel que, tras sumergirse en una muestra procesada, indica si hay virus de zika y dengue
Según explican, el éxito de su plataforma está asociado con la proteína Cas13 que, cuando localiza y corta su objetivo específico, se activa y corta indiscriminadamente otros ARN cercanos. Para crear SHERLOCK, el equipo se basó en esta actividad y diseñó el sistema para que fuera compatible tanto con el ADN como con el ARN.
El potencial de diagnóstico de SHERLOCK –añaden los autores– se basa en hebras adicionales de ARN sintético que se utilizan para crear una señal tras ser escindido. Cas13 cortará este ARN después de que golpee su objetivo original, liberando la molécula de señalización, lo que da como resultado una lectura que indica la presencia o ausencia del objetivo.
Los científicos han aplicado las capacidades de esta enzima para desarrollar un test que utiliza una tira de papel que, tras sumergirse en una muestra procesada, indica con una línea si la molécula objetivo se detectó o no, de forma similar a lo que sucede con los test de embarazo.
“Estos avances aceleran la capacidad de SHERLOCK para detectar de forma rápida y precisa las firmas genéticas, incluidos patógenos y el ADN tumoral, en muestras”, subraya Jonathan Gootenberg, líder del estudio.

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